Die Sammlung Wilhelm Busch ist die bedeutendste und umfangreichste ihrer Art. Sie umfasst derzeit 341 Gemälde, mehr als 1.300 Zeichnungen nach der Natur, 51 Bildergeschichten-Handschriften, rund 900 Briefe sowie 193 Gedicht- und Prosahandschriften des Künstlers. Hinzu kommen ein Archiv sowie die auf Wilhelm Busch spezialisierte, rund 2.500 Bände umfassende Bibliothek.

Der Sammlungsaufbau erfolgte in den wesentlichen Zügen bereits in den ersten beiden Jahrzehnten nach Gründung der Wilhelm-Busch-Gesellschaft im Jahr 1930.

So war die Erwerbslage in diesen frühen Jahren noch außerordentlich günstig, da sich der bedeutendste Teil der künstlerischen Hinterlassenschaft von Wilhelm Busch nach wie vor im Eigentum der Familien seiner Neffen Otto, Hermann und Adolf Nöldeke sowie bei den Verlagen Braun & Schneider und Bassermann befand, die seine großen Bildergeschichten veröffentlicht hatten. Möglich wurden die frühen Erwerbungen vor allem durch das finanzielle Engagement der Stadt Hannover. Parallel gelangte eine große Zahl an Arbeiten als Schenkungen der Erben des Künstlers und anderer privater Förderer in den Bestand. Nachdem die städtische Unterstützung für den Ankauf von Busch-Werken nach dem Krieg reduziert wurde, gewannen ab den 1950er-Jahren zunehmend neugegründete Institutionen als Förderer der Wilhelm-Busch-Sammlung an Bedeutung. Daneben tragen bis heute immer wieder private Schenkungen und Vermächtnisse dazu bei, dass die Sammlung Wilhelm Busch weiter ausgebaut werden kann.

Als erste große Bildergeschichte kam 1932 die Original-Handschrift der »Frommen Helene« (1872) in die Sammlung. Nur wenige Monate später folgte bereits als Dauerleihgabe der Stadt Hannover die Bildergeschichten-Handschrift von Buschs populärstem Werk – »Max und Moritz« (1863/64). Fast zeitgleich konnten die ersten beiden Kapitel der Bildergeschichten-Handschrift von »Maler Klecksel« (1884) angekauft werden. Diesem furiosen Auftakt schlossen sich in den nachfolgenden Jahren die Erwerbungen von zahlreichen weiteren prominenten Bildergeschichten-Handschriften an, die als Dauerleihgaben der Stadt Hannover oder als Eigentum der Wilhelm-Busch-Gesellschaft e.V. in die Sammlung aufgenommen werden konnten. Zu diesen bedeutenden frühen Neuzugängen gehören u. a. die Originalzeichnungen zu »Schnurrdiburr oder Die Bienen« (1867/68), »Der Heilige Antonius von Padua« (1869), »Julchen« (1877), »Fipps der Affe« (1878), »Die Bilderpossen« (1863), »Der Eispeter«, »Katze und Maus«, »Krischan mit der Piepe« und »Hänsel und Gretel«. Gleichzeitig gingen aber auch weniger umfängliche, dafür aber nicht minder bekannte Bilderhandschriften wie »Der hohle Zahn« (1868) oder »Die Brille« (1870) in den Bestand ein.

Mit der Übernahme des Bassermann-Archivs kamen 1966 herausragende Neuzugänge dazu: Alle zu diesem Zeitpunkt noch beim Verlag Friedrich Bassermann in München befindlichen Zeichnungen – darunter die Reinzeichnungen von berühmten Bildergeschichten wie von »Plisch und Plum« (1882), »Balduin Bählamm« (1883) und »Maler Klecksel« (1884) – konnten ebenso wie Manuskripte, Holzstöcke, Erstausgaben und Briefe des Künstlers für die Sammlung erworben werden.

Durch den seit Sammlungsbeginn systematisch durchgeführten Erwerb von Gemälden und Zeichnungen nach der Natur ist ein Bestand an Werken vorhanden, mit dem alle künstlerischen Schaffensbereiche und Entwicklungen von Wilhelm Busch dokumentiert werden. Der Bogen reicht von frühen Studienarbeiten aus den 1850er-Jahren über souveräne Portrait- und Naturdarstellungen aus der mittleren Schaffensphase bis hin zu den emotional aufgeladenen und in ihrer Formauflösung an der Schwelle zur abstrakten Kunst des 20. Jahrhunderts stehenden Landschaftsdarstellungen aus der ersten Hälfte der 1890er-Jahren.

Eine weitere Facette aus Buschs vielseitigem Werk spiegeln die in der Sammlung vertretenen Gedicht- und Prosahandschriften des Künstlers. Zu diesem Komplex gehören die Originalmanuskripte der Gedichtsammlungen »Hernach« (1892/99), »Zu guter Letzt« (1899/1903) ebenso wie die Originalmanuskripte der Prosawerke »Eduards Traum« (1891) und »Der Schmetterling« (1894). Die im Sammlungsbestand enthaltenen rund 900 Originalbriefe des Künstlers ermöglichen gemeinsam mit den beiden von ihm verfassten Selbstbiographien »Was mich betrifft« (1886) und »Von mir über mich« (1893) weitere wichtige Einblicke ins Leben und Werk von Wilhelm Busch. 

Eine Federzeichnung von 1894 ist das berühmteste Selbstporträt von Wilhelm Busch, und nach einem Bieterkrimi befindet es sich dort, wo es hingehört: im hannoverschen Wilhelm-Busch-Museum. Das Selbstporträt, so klein es mit fünfzehn Zentimetern Höhe und zehn Zentimetern Breite ist, hat unser aller Bild des großen Bild-Erzählers geprägt. Es prangt auf Buchumschlägen und es ziert den Wikipedia-Eintrag zu Busch. Dabei war das Original der Zeichnung lange nicht mehr öffentlich zu sehen. Von dem österreichischen Privatsammler Reinhard Knauer im Jahr 1908 für 150 Reichsmark direkt aus Buschs Nachlass erworben, blieb es kontinuierlich im Besitz derselben Familie, die es letztmalig 1949 zur Verfügung gestellt hatte, um eine Reproduktion im Katalog einer Wiener Wilhelm-Busch-Ausstellung zu ermöglichen. Zuletzt jedoch wusste niemand mehr, wo sich die Zeichnung befand, bis sie am 20. Oktober 2020 auf einer Versteigerung des Wiener Auktionshauses Dorotheum angeboten wurde. Mit Unterstützung der Ernst von Siemens Kunststiftung und privater Spenden aus der Wilhelm-Busch-Gesellschaft e. V. gelang dem Museum der Ankauf. Das Bild sei in übertragenem Sinne heimgekehrt, sagte die Direktorin Gisela Vetter-Liebenow bei der Vorstellung der Zeichnung. Und Martin Hoernes, Generalsekretär der Siemens Kunststiftung: „Das Bild musste nach Hannover.“ Der Auktionspreis von 50.300 Euro übertraf die Schätzung um mehr als das Doppelte.